悬液样品的纯度 待染色的悬液样品虽然不要求很纯，但如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在将会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不要有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此最好进行适当的提纯。

悬液样品的浓度 样品悬液的浓度要适中，否则太稀时在电镜下寻找样品将很困难;太浓时，样品的堆集会影响观察。因此第一次制样时，同时用几种浓度的样品进行滴样，从而采用浓度适中的铜网进行观察。一般负染色技术通常要求每份样品至少含有10^7/ml目标颗粒，才能被观察到。

样品和染色液的均匀分布问题 生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜。使用其它支持膜，在电镜观察时往往会发生样品漂移，而不容易拍摄到好的照片。但是由于碳膜的疏水性会使样品及染色液凝集，在电镜观察时往往由于样品和染色剂浓密的堆集而无法看清样品的结构细节。为了提高染色效果，需要设法促进样品和染料的均匀分散，可采用以下方法:

{使用分散剂} 常用分散剂有牛血清蛋白(BSA)，适用于高度纯化的颗粒性悬液。方法是把0.005%~0.05%牛血清蛋白溶液加到样品悬液内，所加量无严格的规定，先加数滴，如果仍不见效可适当增加;也可以直接用0.01%BSA作为离心沉淀物的稀释液。此外，也可以用杆菌肽，按30~50μg/ml的浓度用蒸馏水配制成溶液，用作沉淀物的稀释液。或将样品悬液，PTA和杆菌肽溶液三者等量混合后滴样。 {亲水性处理} 对碳膜进行亲水性处理方法如下:把覆盖在铜网上的碳膜放在离子溅射仪中，在10Pa~1Pa的真空中用离子轰击(蚀刻)几秒钟，碳膜即由疏水性变为亲水性。用这种碳膜就不存在样品与染色剂凝集的问题。但要注意碳膜经亲水性处理后，经过1~2天又会变为疏水性的，因此最好亲水性处理后立即使用。 样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度会对负染色的结果产生较大的影响。为了确保生物样品有足够的缓冲条件，一般用2%醋酸铵或硫酸铵作缓冲液效果较好，并且使悬液的酸碱度呈中性或稍偏酸为宜。

染色液的酸碱度不仅影响到染色液的扩散，而且会对病毒的形态造成一定影响。负染色在制备过程中只要pH值有微小的变化就可能产生不同的形象，有时不仅不能获得良好的负反差，相反会出现正染色的效果。某些负染色剂及其pH的参考值见表: